A Ilha de Santo Amaro surge em sua atual forma no final da Era Glacial, entre 20 e 123 mil anos, quando o Canal de Bertioga e o Estuário de Santos são abertos com a contínua elevação do nível do Oceano Atlântico e criam a atual ilha, a separando do continente.
Os primeiros habitantes foram os homens dos sambaquis, grupo humano seminômade que habitou o litoral sul/sudeste brasileiro após o final da Era Glacial. Este povo vivia da coleta de moluscos, conchas, mexilhões e demais alimentos marinhos, bem como alimentos vegetais e caça de pequenos animais e peixes. Não conheciam a agricultura e seu único registro conhecido são os montes de restos de conchas espalhados pelo litoral, chamados de sambaquis. Em Guarujá, foram localizados sambaquis nas praias da Ilha do Mar Casado e Pernambuco.
Após a era dos sambaquis, a ilha passa a ser visitada por grupos tupi, que deram o primeiro nome à ilha: Guaibê (lugar de caranguejos) e também Guaru-ya (passagem estreita). Os tupis não habitaram a ilha, permanecendo no entorno da Serra do Mar e no Planalto Paulista, mas utilizavam a ilha para a colheita de sal e pesca.
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